20260916-02-后续方案（暂定）

后续整体实验安排

本批实验总体围绕"CRS × VNS"两个因素继续进行。

1. D1—D14：慢性干预

CRS+Sham及CRS+VNS两组继续每日进行2 h CRS束缚造模。

Control+VNS及CRS+VNS两组继续按照统一参数进行VNS：

• 频率：30 Hz
• 脉宽：500 μs/phase
• 电流：±300 μA
• 刺激方式：连续刺激
• 刺激时间：5 min/只

后续14 d内原则上保持每日实验条件、操作方式及刺激参数一致，并持续记录动物一般状态、电极状态及实验过程中出现的异常情况。

波形资料以代表性留存为主，并计划在D1、D7及D14等关键节点重点记录，用于后续评价慢性使用过程中刺激输出的稳定性。

2. CRS完成后的行为学检测

14 d慢性干预完成后，对四组动物进行行为学复测。

行为学项目原则上与造模前的基线检测保持一致，主要包括：

• 旷场实验（OFT）：评价整体自主活动及中心区探索行为
• 悬尾实验（TST）：记录静止时间等指标
• 糖水偏好实验（SPT）：评价糖水偏好变化

由于本批小鼠在正式分组前已经完成OFT、TST及SPT基线检测，因此后续除比较四组造模后的行为差异外，还可以结合每只动物造模前后的自身变化进行分析。

3. 行为学完成后的组织学检测

行为学检测全部完成后，计划统一进行取材，并重点观察孤束核（NTS）区域。

目前拟将组织学主线设置为：

• GAD67 + ΔFosB/FosB共染，并使用DAPI进行细胞核染色

其中：

• GAD67：用于标记GABA能神经元
• ΔFosB/FosB：用于评价经历14 d CRS及重复VNS后NTS神经元较长期的活动状态变化

最终重点比较四组动物中：

1. NTS区域ΔFosB/FosB表达情况
2. GAD67阳性神经元中的ΔFosB/FosB表达情况
3. GAD67与ΔFosB/FosB共表达细胞比例

GPBAR1目前作为后续可扩展指标保留，如后续结合课题组既往研究结果后认为有必要，可进一步增加GPBAR1染色，形成GAD67、ΔFosB/FosB、GPBAR1三标并联合DAPI观察。

本阶段实验目的

本阶段实验首先观察自制慢性迷走神经电极在连续实验条件下能否稳定完成VNS刺激；在此基础上，通过14 d CRS建立慢性应激模型，结合VNS干预及造模前后行为学检测，观察VNS对CRS相关行为改变的影响。

实验结束后进一步通过NTS区域GABA能神经元相关组织学检测，观察CRS及VNS干预后中枢神经元长期活动状态是否存在差异，从而为后续学位论文中的行为学及组织学结果提供依据。